Hogyan kell festeni Gramot (képekkel)

Tartalomjegyzék:

Hogyan kell festeni Gramot (képekkel)
Hogyan kell festeni Gramot (képekkel)

Videó: Hogyan kell festeni Gramot (képekkel)

Videó: Hogyan kell festeni Gramot (képekkel)
Videó: Ez a 12 Éves Lány Egy Pszichopata...Nem Fogod Elhinni Hogy Mit Tett!!! [LEGJOBB] 2024, Március
Anonim

A Gram festés egy gyors eljárás, amellyel a baktériumok jelenlétét keresik a szövetmintákban, és a baktériumokat Gram-pozitív vagy Gram-negatívként jellemzik, a sejtfaluk kémiai és fizikai tulajdonságai alapján. A Gram -festést szinte mindig a bakteriális fertőzés diagnosztizálásának első lépéseként kell elvégezni.

A Gram folt a dán tudós, Hans Christian Gram (1853 - 1938) nevéhez fűződik, aki 1882 -ben fejlesztette ki ezt a technikát, és 1884 -ben tette közzé, mint technikát kétféle, hasonló klinikai tünetekkel rendelkező baktériumfaj megkülönböztetésére: Streptococcus pneumoniae (más néven: a pneumococcus) és a Klebsiella pneumoniae baktériumok.

Lépések

Rész 1 /3: Gramfolt előkészítése

Gram Folt 1. lépés
Gram Folt 1. lépés

1. lépés Készüljön fel a laboratóriumi munkára

Vegyen fel kesztyűt és kösse vissza a hosszú haját, hogy megakadályozza a vizsgálandó baktériumminta szennyeződését. Fertőtlenítse a munkaterületet a füstelszívó alatt, vagy más jól szellőző helyen. Mielőtt elkezdené, ellenőrizze, hogy a bunsen -égő és a mikroszkóp működik -e.

Gram Folt 2. lépés
Gram Folt 2. lépés

2. lépés Sterilizálja az üveg mikroszkóp tárgylemezét

Ha az üveglemez piszkos, mossa le szappanos vízzel, hogy eltávolítsa a zsírt és a szennyeződést. Fertőtlenítse a tárgylemezt etanollal, üvegtisztítóval vagy a laboratórium által javasolt módszerrel.

Gram Folt 3. lépés
Gram Folt 3. lépés

3. lépés. Adja hozzá a mintát a tárgylemezhez

A Gram festési módszerrel azonosíthatja az orvosi mintákban lévő baktériumokat vagy a Petri -csészében termesztett baktériumtenyészeteket. Annak érdekében, hogy a Gram -folt hasznos legyen, adjon hozzá a vékony réteg mintát a folton. 24 óra alatti minta ajánlott, mivel az idősebb baktériumok károsíthatják a sejtfalakat, amelyek kevésbé kiszámíthatóan reagálnak a grammos festésre.

  • Ha szövetmintát használ, adjon 1-2 cseppet az üveglemezre. A második sterilizált üveglap szélét használva egyenletesen kenje szét a tárgylemezen, hogy vékony kenetet képezzen. Hagyja levegőn megszáradni, mielőtt folytatja.
  • Ha baktériumokat vesz Petri -csészéből, sterilizálja az oltókört Bunsen -égő lángjában, amíg fel nem világít, majd hagyja lehűlni. Használjon hozzá egy csepp steril vizet a tárgylemezre, majd sterilizálja és hűtse le újra a hurkot, mielőtt apró baktériummintát visz át és óvatosan keveri a vízbe.
  • A húslevesben lévő baktériumokat egy örvényben kell összekeverni, majd egy oltóhurokkal kell hozzáadni a fentiek szerint, a további víz hozzáadása nélkül.
  • Ha van pálcikamintája, görgesse meg enyhén a fóliát a tárgylemezen.
Gram Folt 4. lépés
Gram Folt 4. lépés

Lépés 4. Melegen rögzítse a kenetet

A hő rögzíti a baktériumokat a tárgylemezhez, így nem lehet őket olyan könnyen leöblíteni a folt során. Gyorsan vezesse át a tárgylemezt kétszer -háromszor egy Bunsen -égő lángján, vagy melegítse fel egy elektromos tárgymelegítő tetején. Ne melegítse túl, mert a minták torzulhatnak. Ha Bunsen égőt használ, a lángnak kicsi, kék kúpnak kell lennie, nem pedig magas narancssárgának.

Alternatív megoldásként a kenetet metanollal is rögzíthetjük, 1-2 csepp metanolt adva a szárított kenethez, leengedve a felesleges metanolt, és hagyva levegőn megszáradni. Ez a módszer minimalizálja a gazdasejtek károsodását, tisztább hátteret biztosítva

Gram Folt 5. lépés
Gram Folt 5. lépés

5. lépés. Helyezze a tárgylemezt egy festőtálcára

A festőtálca egy sekély fém, üveg vagy műanyag edény, amelynek tetején kis háló vagy dróttartó fut. Helyezze a csúszkát a tartó tetejére, hogy a használt folyadékok lefolyhassanak a tálcába.

Ha nincs festőtálcája, akkor a tárgylemez közvetlenül a műanyag jégkocka tálca tetejére helyezhető

2. rész a 3 -ból: A Gram -folt végrehajtása

Gram Folt 6. lépés
Gram Folt 6. lépés

1. lépés: A kenetet elöntjük kristályibolyával

Pipettával árasztja el a baktériummintát néhány csepp kristályibolya festékkel, amelyet néha gencián ibolyának is neveznek. Várjon harminc -hatvan másodpercet. A kristályibolya (CV) vizes oldatokban CV+ és klorid (Cl–) ionokká disszociál. Ezek az ionok áthatolnak a gram-pozitív és a gram-negatív sejtek sejtfalán és sejtmembránján. A CV+ ion kölcsönhatásba lép a baktériumsejtek negatív töltésű alkotóelemeivel, és lilára festi a sejteket.

Sok laboratórium "Hucker" kristályibolyát használ, amely ammónium -oxalátot ad a csapadék megakadályozásához

Gram Folt 7. lépés
Gram Folt 7. lépés

2. lépés Óvatosan öblítse le a kristályibolyát

Döntse meg a tárgylemezt, és mosópalackkal permetezzen egy kis desztillált vagy csapvizet a tárgylemez tetejére. A víznek le kell folynia a kenet felületén, de nem közvetlenül rá kell irányítani. Ne öblítse túlzottan, mert eltávolíthatja a foltot a Gram -pozitív baktériumoktól.

Gram Folt 8. lépés
Gram Folt 8. lépés

3. lépés: A kenetet jóddal árasztja el, majd öblítse le

Pipettával fedje le a kenetet jóddal. Hagyja hatni legalább 60 másodpercig, majd öblítse le ugyanolyan óvatos módszerrel. A jód negatív töltésű ionok formájában kölcsönhatásba lép a CV+ -val, és nagy kristályibolya- és jódkomplexeket (CV – I komplexek) képez a sejt belső és külső rétegeiben. Ez csapdába ejti a lila kristálylila színt a cellában, bárhol is foltosodott.

A jód maró hatású. Kerülje a belélegzést, lenyelést vagy bőrrel való érintkezést

Gram Folt 9. lépés
Gram Folt 9. lépés

4. lépés. Adjon hozzá egy színtelenítőt, majd gyorsan öblítse le

Ehhez a kritikus lépéshez általában aceton és etanol 1: 1 arányú keverékét használják, amelyet óvatosan kell időzíteni. Tartsa ferdén a tárgylemezt, majd adja hozzá a színtelenítőt, amíg a leeresztő lefolyóban már nem látszik tovább ibolyaszín. Ez általában 10 másodperc alatt, vagy még kevesebb idő alatt tart, ha a színtelenítő nagyobb koncentrációban tartalmaz acetont. Azonnal állítsa le, különben a színtelenítő eltávolítja a kristályibolya foltot mind a gram-pozitív, mind a negatív sejtekről, és a festést meg kell ismételni. A felesleges színtelenítőt azonnal öblítse le a korábbi módszerrel.

  • Ehelyett tiszta (95%+) acetont használhatunk. Minél több aceton van, annál gyorsabban fog működni a színtelenítő, ami pontosabb időzítést igényel.
  • Ha problémái adódnak ennek a lépésnek az időzítésével, fontolja meg cseppenként a színtelenítő hozzáadását.
Gram Folt 10. lépés
Gram Folt 10. lépés

5. lépés: A kenetet ellepje ellenfestékkel, majd öblítse le

Egy ellenfestéket, tipikusan szafranint vagy fuksint használnak, hogy extra kontrasztot hozzanak létre a gram-negatív és gram-pozitív baktériumok között, elszíneződött (gram-negatív) baktériumokat rózsaszínre vagy pirosra festve. Hagyja rajta legalább 45 másodpercig, majd öblítse le.

A Fuchsin intenzívebben fest sok gram-negatív baktériumot, például a haemophilus spp. És a legionella spp. Ez jobb választássá teheti a kezdők számára

Gram Folt 11. lépés
Gram Folt 11. lépés

6. lépés Szárítsa meg a tárgylemezt

Hagyja, hogy a tárgylemez megszáradjon, vagy törölje szárazra az erre a célra értékesített bibliai papír segítségével. A Gram festés befejeződött.

Rész 3 /3: Az eredmény vizsgálata

Gram Folt 12. lépés
Gram Folt 12. lépés

1. lépés. Készítse elő a fénymikroszkópot

Helyezze a tárgylemezt a fénymikroszkóp alá. A baktériumok nagymértékben különböznek, így a teljes nagyítás 400x és 1000x között változhat. Ezeknek a nagyításoknak a végén az olajba merülő objektív lencse ajánlott a nagyobb tisztaság érdekében. Tegyen egy csepp merülőolajat a tárgylemezre, elkerülve a mozgást az alkalmazás során, hogy megakadályozza a buborékok kialakulását. Mozgassa a mikroszkóp tornyát úgy, hogy az objektív a helyére kattanjon, és megérintse az olajat.

Olajmerítés csak speciálisan tervezett lencséken használható, "száraz" lencsén nem

Gram Folt 13. lépés
Gram Folt 13. lépés

2. lépés. Gram-pozitív és gram-negatív baktériumok azonosítása

Vizsgálja meg a tárgylemezt a fénymikroszkóp alatt. A Gram-pozitív baktériumok lila színűnek tűnnek a vastag sejtfalaikban rekedt kristályibolya miatt. A Gram-negatív baktériumok rózsaszínnek vagy vörösnek tűnnek, mivel az ibolya átmosta a vékony sejtfalakat, majd a rózsaszín ellenfolt lépett be beléjük.

  • Ha a minta túl vastag, hamis pozitív eredményeket láthat. Vizsgáljon új mintát, ha minden baktériumtípus gram-pozitív, hogy megbizonyosodjon arról, hogy az eredmény helyes.
  • Ha a színtelenítő túl sokáig futott, hamis negatív eredményeket láthat. Vizsgáljon új mintát, ha minden baktériumtípus gram-negatív, hogy ellenőrizze az eredményeket.
Gram Folt 14. lépés
Gram Folt 14. lépés

3. lépés. Keresse meg a referenciaképeket

Ha nem biztos abban, hogy mi a baktérium, nézze át a referenciaképek gyűjteményét, formájuk és a grammos folt eredménye szerint rendezve. Az adatbázisokat megtalálhatja online a Nemzeti Mikrobiológiai Kórokozó Adatbázisban és sok más webhelyen. Az azonosítás megkönnyítése érdekében a gyakori vagy diagnosztikai szempontból fontos példákat az alábbiakban grammos állapot és alak szerint soroljuk fel.

Gram Folt 15. lépés
Gram Folt 15. lépés

4. lépés. Gram-pozitív baktériumok azonosítása alakjuk alapján

A baktériumokat a mikroszkóp alatt alakjuk szerint osztályozzák, leggyakrabban kokcuk (gömb alakú) vagy rudak (hengeres). Íme néhány gyakori gram-pozitív (lila foltos) baktérium, amelyek alakjuk szerint vannak rendezve:

  • Gram-pozitív kokcuk általában vagy Staphylococcusok (jelentése klaszterekben található kokkuszok) vagy Streptococcusok (jelentése láncokban lévő kokkuszok).
  • Gram-pozitív rudak többek között a Bacillus, a Clostridium, a Corynebacterium és a Listeria. Actinomyces spp. a rudak gyakran ágakkal vagy szálakkal rendelkeznek.
Gram Folt 16. lépés
Gram Folt 16. lépés

5. lépés. Gram-negatív baktériumok azonosítása

A Gram-negatív (rózsaszínű) baktériumokat gyakran három csoportba sorolják. A kokók gömb alakú baktériumok, a rudak hosszú, vékony baktériumok, és a kokcid rudak valahol a kettő között vannak.

  • Gram-negatív cocci leggyakrabban a Neisseria spp.
  • Gram-negatív rudak az E. coli, az Enterobacter, a Klebsiella, a Citrobacter, a Serratia, a Proteus, a Salmonella, a Shigella, a Pseudomonas és még sokan mások. A Vibrio cholerae közönséges rudak vagy ívelt rudak formájában jelenhet meg.
  • Gram-negatív "kokcid" rudak (vagy "coccobacillusok") Bordetella, Brucella, Haemophilus és Pasteurella.
Gram Folt 17. lépés
Gram Folt 17. lépés

6. lépés. Értékelje a vegyes eredményeket

Sejtfaluk törékenysége vagy viaszossága miatt egyes baktériumokat nehéz pontosan megfesteni. Lehet, hogy lila vagy rózsaszín foltot tartalmaznak ugyanabban a sejtben, vagy ugyanazon kenet különböző sejtjei között. Bármely 24 óránál régebbi baktériumminta okozhatja ezt a problémát, de néhány fajt nehéz bármilyen korban megfesteni. Szükségük lehet speciálisabb tesztekre az azonosítás szűkítése érdekében, például saválló festésre, tenyésztési növekedés megfigyelésére, TSI tápközeg tenyészetekre vagy genetikai vizsgálatokra.

  • Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium és Propionibacterium spp. mind gram-pozitív baktériumnak minősülnek, de gyakran nem meggyőzően festettek.
  • Kicsi és karcsú baktériumok, például Treponema, Chlamydia és Rickettsia spp. nehéz megfelelően grammosítani.
Gram Folt 18. lépés
Gram Folt 18. lépés

7. lépés. Az anyagok ártalmatlanítása

A hulladékkezelési eljárások laboratóriumonként és a felhasznált anyagoktól függően eltérőek. A festőtálcában lévő folyadékot jellemzően veszélyes hulladékként zárt palackokba helyezik. A tárgylemezeket áztassa 10% -os fehérítő oldatba, majd dobja éles tárgyakba.

Tippek

  • Ne feledje, hogy a Gram -festés hozama csak olyan jó, mint a minta. Fontos, hogy megtanítsuk a betegeket jó minták készítésére (például a köpés és a köhögés közötti különbség a köpetminták esetében).
  • Színtelenítőként az etanol lassabban hat, mint az aceton.
  • Kövesse a szabványos laboratóriumi óvintézkedéseket.
  • A gyakorlathoz használjon arcpálcát, mivel a mintának gram-pozitív és gram-negatív baktériumokat is tartalmaznia kell. Ha csak egy vagy másik típust lát, akkor valószínűleg túl kevés vagy túl sok színtelenítőt használ.
  • A csúsztatáshoz rugós típusú fa ruhacsipeszt használhat.

Figyelmeztetések

  • Az aceton és az etanol gyúlékony. Az aceton eltávolítja az olajokat a kezéből, így a bőr könnyebben felszívja a többi vegyszert. Viseljen kesztyűt és óvatosan használja.
  • Ne hagyja megszáradni a kenetet, mielőtt leöblítené a foltot vagy az ellenfoltot.

Ajánlott: